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你的WB实验内参是否选择正确?
发布时间:2021-11-24   点击次数:13次

要想底气十足地秀出你的WB实验结果,单单内参对照就是一门知识。在对靶蛋白进行分析时,首先考虑是否等量上样,其次考虑信号是否属于检测的线性范围。那么,内参蛋白就尤为重要!


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通常,第一感觉内参蛋白就是 β-actin 或 GAPDH 等。实际上,可以选择的内参有很多,而选择内参有一定的标准。第一,实验条件不能改变内参蛋白上样量。第二,对照内参的分子量必须与靶蛋白不同。第三,也是最重要的一点,检测到的内参蛋白和靶蛋白的信号必须在一个线性范围内,否则你会发现你的条带无法进行定量。

然而,实际操作中,很多同学没有意识到上述的第三个标准。他们认为,印迹上的内参蛋白数量与细胞数量成正比,但这可能是错误性的假设而已,特别是使用单个内参蛋白对多种 WB 实验进行标准化时。实际上,没有一种内参蛋白能同时满足以上3 点标准,又适用于你各种不同靶点的实验。通常内参蛋白远比靶蛋白丰富得多。在同一稀释度下,测定内参和靶蛋白时,内参蛋白的信号可能较为饱和,甚至会超过检测线性动态范围,这就导致不能报告出泳道之间的差异。

当然 WB 的信号也与检测方法紧密相关。与胶片相比,使用电荷耦合器件 (CCD) 相机检测增强型化学发光 (ECL) 可产生出色的线性动态范围。如果数字信号饱和,则可以使用App设置来显示红色像素。经证实,荧光扫描(使用与荧光染料而不是过氧化物酶偶联的二抗)可避免发光化学的固有限制,因而更好。所以在设置实验时,采用这些方法可能意味着更少的梯度稀释次数。但如果你的实验室无法使用最新最hao的技术,你也可以使用传统ECL 和胶片获得较好的数据,但需要你花时间设置实验,解决等量上样和动态范围问题。

既往还有文献推荐在做实验前,最好考虑使用 5 个内参蛋白,这有助于你发现至少一个(好的时候多个)在靶蛋白线性范围内的内参,但使用多个内参蛋白存在耗费时间、试剂的问题,特别是样品珍贵的情况下。所以相对可行的是测定每个样品泳道中的总蛋白上样量,无需探测多个内参蛋白。对每个泳道的所有蛋白条带或多个离散条带进行染色和扫描,同时还要确保染色剂不会干扰后续的免疫检测。

对于许多研究生和博士后,可能会觉得进行 WB 实验是“常规程序"。但也不要忘了,说明实验的数据时,细节决定成败。仔细考虑样品制备、转移条件和一抗等问题,将帮助你避免出现失误。到了文章发表的时候,记得提供所有详细信息,以便其他人准确评估结果并重复做出实验。这才是负责地进行 WB 实验嘛!

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