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流式与磁珠分选你pick哪个?
发布时间:2021-11-18   点击次数:20次

细胞分选在多种研究领域都有涉及,例如肿瘤学,神经生物学,免疫学等。但是大家对它们的优缺点可能不太清楚,那今天古朵生物在这里跟大家聊一下流式分选的原理、应用及与磁珠分选的区别。

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流式细胞仪分选原理

当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中,被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液,在鞘液的包裹和推动下,细胞被排成单列,以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体,充电后振动,使喷出的液流断裂为均匀的液滴,待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷,当液滴流经过带有几千伏的偏转板时,在高压电场的作用下偏转,落入各自的收集容器中,没有充电的液滴落入中间的废液容器,从而实现细胞的分离。

1.先制备单细胞悬液(可检测多种样本的单细胞悬液:外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞等,如果是无菌实验应该注意无菌操作)
2.样本染色:调节电压与选取目的细胞群(分选前应该做一个预实验,优化仪器的测定条件,建立分选门)
3.细胞分选与收集

流式分选的应用

1.细胞增值、活性和凋亡研究
2.疾病细胞如炎症细胞、肿瘤细胞等的发生、发展和转归研究
3.基因表达和表达调控研究
4.细胞内信号传导和生物大分子间相互作用研究
5.各种病原体如病毒、细菌等基础和致病性和致病机理研究
6.药理药效和药物开发研究
7.移植和细胞治疗研究
8.生物材料对细胞结构、活性和功能的影响

利用仪器的分选功能分选得到高纯度、高活性的稀有细胞,通过直接培养、诱导、增殖、分化、活化和移植等进行更深一步的细胞功能和细胞治疗探索,还可以在此基础上逆向进行基因组合蛋白质组相关研究,寻找致病基因、致病蛋白和疾病信号传导方式。

影响流式分选的因素
1.分选速度:振荡频率(频率越高,速度越快)、鞘液压力、喷嘴大小、上样速度(速度过快,得率会降低,故应该按实验需求来设定)
2.分选纯度:精确设定液滴延迟时间(跑微球去矫正)、保证液流稳定、选择合适的分选模式、排除样本粘连、合理设门(用散点图)、合理阈值设定
3.分选得率:液滴延迟时间要准确、液流稳定、如果不考虑纯度的情况下(不需后续培养),可以选择Enrich/yield分选模式
4.分选活性:细胞本身的活性、仪器洁净程度、鞘液压力、喷嘴大小(对于脆弱细胞,尽量采用低压和大喷嘴,包裹细胞的液滴越大,对细胞的冲击越小)、上样管路设计及管壁光滑程度

免疫磁珠法分离细胞原理

是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合,在外加磁场中,通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中,无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性,不在磁场中停留,从而使细胞得以分离。

免疫磁珠法分为正选法和负选法:

正选法:磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选法:磁珠结合不需要的细胞,游离于上清液的细胞为所需细胞

磁分离细胞的重要指标是:

1.纯度和得率,这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小(磁性),然而太小的磁珠得率不高,太大的磁珠又会影响细胞活性,也无法直接上流式。
2.磁珠大小约为200nm为中等大小磁珠
3.小磁珠的优点是对细胞温和,不影响分离细胞的后续培养,可直接上流式检测,不影响散射光;缺点是需要很强的磁场来分离细胞,分离速度慢,得率不高,需要一次性的分离柱,不能在普通试管进行,成本昂贵。
4.大磁珠的优点是技术简单,分离可在试管中完成,易于增减细胞用量,速度快,得率高,成本低;缺点是对细胞造成机械压力,影响其生物学活性,不利于分离后培养,纯度低,阻塞FCM的喷嘴。


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