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做实验不会制备“细胞爬片”怎么行?
发布时间:2021-11-22   点击次数:22次
  大家在做免疫荧光(IF),激光共聚焦(Confocal),凋亡检测(TUNEL)时,免不了要制备细胞爬片,爬片质量完全决定了最后拍照的质量以及实验数据的精准性。今天,小编就教大家如何制备好的细胞爬片。
 
  爬片的准备
 
  1.爬片可用一般的盖玻片,也可用专用细胞爬片(价格比较昂贵)但是细胞贴壁牢固,拍出照片效果好;
 
  2.可根据自己的需要,到染色时再将之切开,这样既保证了细胞均一性,又可同时做几个指标的染色剪裁成合适大小,置于6孔板、12孔板或24孔板;细胞爬片(以常用24孔板为例)
 
  1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
 
  2.加细胞时,根据玻片的大小,先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基,目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起,然后放玻片,防止加细胞悬液时玻片漂起,造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作,玻片是无菌处理的,可以酒精灯外火焰附近做。
 
  3.根据自己的需要,选择合适的细胞密度(细胞太密影响拍照效果),将计数分好的细胞混匀后铺到孔中,种入24孔板一个孔内即可。
 
  4.待细胞贴壁后,可去上清加处理组培养基。
 
  5.按照实验设计,作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧,张力较大,将注射器针头针尖向背面弄个小钩,这样将爬片轻轻勾起,用小镊子取出就可以了。
 
  如果要做诸如24h,48h,72h等不同时间点实验的话,将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。
 
  爬片细胞的固定处理
 
  以下为常用的固定液:
 
  1.冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。
 
  将纯丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮(此温度不会为固体的)细胞爬片取出后,PBS洗2遍,加入冷丙酮于-20℃(丙酮有很强的挥发性,注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严,防止其挥发)固定10min。取出后,室温吹干,然后放入-20℃保存。
 
  2.多聚甲醛(常用4%):避光保存,可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 室温固定15-30min后,将表面液体吹干, -20℃保存
 
  3.95%乙醇,可用于免疫组化。
 
  优点:穿透性强、抗原性保存较好。
 
  缺点:但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差,使蛋白变性的作用轻,固定后可再溶解;染色过程中,孵育时间长,抗原可流失而减弱反应强度。室温固定15min后,将表面液体吹干,入-20℃保存
 
  4.甲醛
 
  优点:形态结构保存好,且穿透性强,
 
  缺点: 甲醛放置过久可氧化为甲酸,使溶液pH降低,影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇,使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。
 
  小编将以多聚甲醛为例,讲讲24孔板内,细胞爬片固定步骤:
 
  1.准备多聚甲醛(PFA): 4℃冰箱保存。
 
  2.将细胞从37℃培养箱取出,用预温的PBS洗3遍,每次加入1ml PBS,轻轻晃动,避免将细胞冲掉。
 
  3.注意爬片的细胞面向上,每孔用4℃的多聚甲醛500ul即可,室温固定30-40min,避光。
 
  4.固定后,用PBS洗三次。
 
  5.0.2-0.5%Triton X-100透化10-20min,覆盖细胞即可。
 
  6.PBS洗三次。如果是做免疫荧光
 
  7.后续用3%的BSA,用PBS配置,封闭1h。
 
  8.封闭后,用PBS洗三遍,按比例加入一抗,4℃过夜,若转入荧光标签的质粒,要避光。
 
  9.过夜后,用预温的PBS洗细胞,动作轻缓,可多洗一会儿,可以用慢摇床摇。
 
  10.加入用3%BSA稀释的二抗,室温孵育1h,避光。
 
  11.孵育结束后,避光用PBS洗3次,动作轻缓,可以多洗一会儿。
 
  12.1ug/mL DAPI ,室温避光,染细胞核DNA 20min。
 
  13.PBS洗三次。
 
  细胞爬片封片
 
  1.将载玻片洗好在干净无尘纸上晾干 。
 
  2.将PBS中的细胞取出,注意细胞面朝下,载玻片上滴入亮甲油,或者防防猝灭封片剂,盖在载玻片上(市面上可以买到封片防猝灭剂)。
 
  细胞爬片取出后,一般用PBS洗2遍,然后做固定。根据研究目的,PBS洗也不是一定要做的,比如做凋亡TUNEL染色时就避免洗,凋亡细胞在洗的过程中可能会脱落。
 
  保存细胞爬片时,一般用培养皿或避光湿盒,先在皿底放一层面巾纸,然后再放爬片,这样方便做实验时取片。然后盖上盖子,并在盖子上做标记,为避免混淆。一般-20℃保存2-3月的片子去拍照没有问题的。制备好的细胞爬片是不是很简单呢?
 

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