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马住!流式细胞术实用技巧!
发布时间:2021-11-19   点击次数:29次
  流式细胞技术(flow cytometry,FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。流式细胞术是单克隆抗体及免疫细胞化学技术、激光和电子计算机科学等高度发展及综合利用的高技术产物。
 
  一、基本结构
 
  流式细胞仪由三部分构成
 
  1.液流系统,包括流动室和液流驱动系统;
 
  2.光学系统,包括激发光源和光束收集系统;
 
  3.电子系统,包括光电转换器和数据处理系统。流式细胞仪的I作原理是使悬浮在液体中分散的经荧光标记的细胞或微粒逐个通过样品池,同时由荧光探测器捕获荧光信号并转换成分别代表前向散射角、侧向散射角和不同荧光强度的电脉冲信号,经计算机处理形成相应的点图,直方图和加三维结构图像进行分析。用于FCM的样本是单细胞悬液,可以是血液、悬浮细胞培养液、各种体液、新鲜实体瘤的单细胞悬液以及石蜡包埋组织的单细胞悬液等。
 
  二、流式细胞术的基本操作与技巧
 
  1)细胞的制备、培养
 
  2)封闭
 
  3)荧光素偶联抗体标记
 
  4)光电倍增管电压的设定
 
  5)对照的设置
 
  6)补偿调节
 
  以体外培养的PBMC细胞为例:
 
  1、细胞培养在96孔板中,直接收集细胞于1.5ml的EP管中,350g,4°C离心5min,弃上清;
 
  2、然后用1ml FACS buffer重悬沉淀,350g,4°C离心5min,弃上清;
 
  3、封闭:标记样品细胞的荧光素偶联抗体多为单克隆抗体,少数也可能是多克隆抗体,其基本结构都由两部分组成,即包含有特异性结合抗原位点的Fab段和相对保守的Fc段,抗体的特异性表现在Fab段,标记时利用Fab段的抗原结合位点与细胞上抗原分子特异性结合,从而标记并且相对量化细胞表达该抗原分子的情况。但是,有些细胞表面表达FcR(Fc receptor, Fc受体),如巨噬细胞、DC、B淋巴细胞等, FcR可以与荧光素偶联抗体的Fc段进行非特异性的结合,对结果产生一定的影响。
 
  封闭方法1: 取适量的血清全IgG抗体与样品细胞充分混匀,4C静置 15min。研究人的细胞时,若荧光素偶联抗体来源于小鼠,封闭采用小鼠血清全IgG抗体。原则是,如果流式抗体可能与样品细胞的FcR发生非特异性结合,那么在标记荧光素偶联抗体之前先用流式抗体同源的全IgG抗体进行封闭,使样品细胞表面的FcR饱和。
 
  封闭方法2: 适量的抗CD16和抗CD32单克隆抗体与样品细胞充分混匀,4C静置 15min。CD16是一种FcR, 能够与IgG的Fc段结合,亲和力较强;CD32也是一种 FcR, 能够与IgG的Fc段结合,亲和力中等。而荧光素偶联抗体基本上是IgG抗体,所以在标记荧光素偶联抗体前可以用抗CD16和抗CD32单克隆抗体封闭样品细胞,使样品细胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32单克隆抗体结合,从而阻止后续荧光素偶联抗体与FcR的非特异性结合。
 
  4、标记相应的荧光素偶联抗体,这里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC为例,一般染色体系推荐100μl,CD3、CD4表达量相对较高,1μl足够了,假如有9个样本,分别取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中,混匀后,分别取100μl加到9个样品孔中,混匀,室温、避光染色20min;
 
  5、加1ml FACS buffer洗去未结合的抗体,350g,4°C离心5min,弃上清,用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重悬沉淀,尽快上机分析。
 
  6、电压的设定:上机分析时,确认机器没有问题后,首先就是调节每个通道的光电倍增管的电压,目的是为了区分细胞群,假如大家想研究人的淋巴细胞群,大家都知道人的PBMC含有淋巴细胞、单核细胞还有中性粒细胞等,那大家怎么把它们分开呢?这时候就要用到大家前面提过的FSC和SSC,通过调节FSC和SSC的电压,区分淋巴细胞亚群,原则就是使样品细胞或者目标细胞位于流式图的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的电压确定之后就开始调节APC-cy7、FITC的电压(大家可以在铺细胞的时候多铺一个孔,染色时将CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上,用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC电压的调节),原则就是使阳性细胞群和阴性细胞群尽可能的分离。
 
  三、注意事项
 
  (1)在细胞制备、培养阶段,如果该培养细胞是贴壁细胞,需用先用胰酶消化细胞,然后收集待测样品细胞,离心、洗涤、封闭后标记荧光素偶联抗体即可。
 
  (2)如果是胸腺、脾脏和淋趋承等外周免疫器官,主要由免疫细胞组成,制成单细胞悬液,只需直接将脏器经钢网研磨即可。
 
  (3)如果是实体脏器肺脏、肝脏和肿瘤组织内含有较多的结缔组织,实体脏器细胞之间一般结合紧密,所以直接研磨脏器法无法得到理想的单细胞悬液。因此,研磨前需将脏器剪碎后加入IV型胶原酶和DNA核酸内切酶消化,消化后的组织再用研磨棒直接研磨。实体脏器研磨后的单细胞悬液以实体细胞为主,如果研究目标不是实体细胞,而是脏器内浸润的免疫细胞,可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞,然后再进行流式分析。
 
  (4)调节电压时,如果检测的目标细胞体积较小,可以适当提高电压值,使目标细胞与细胞碎片在流式图中能够完全分离;如果检测的目标细胞体积较大,可以适当降低电压值,使所有的目标细胞群完整显示于流式图中,防止细胞群接近于流式图的边界而变形扭曲或者完全处于边界外。
 
  (5)关于样本的封闭,并不是标记荧光素偶联抗体之前必须封闭样品,一般样品细胞与流式抗体的种属来源是不同的,如标记人的细胞的荧光素偶联抗体一般来源于小鼠,人细胞的FcR也不一定能够与小鼠来源的荧光素偶联抗体的Fc段结合,但是,也有可能因为种属关系较近,或者在一定环境条件下这种不同种属间的Fc段和FcR也能结合,实验者很难判断实验过程中这种结合是否会发生,但是在标记荧光素偶联抗体前封闭样品却可以保证这种非特异性结合一定不会发生。所以,条件允许的话,实验者最好养成封闭样品的习惯。

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