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怎么建稳转株才能真的稳?
发布时间:2020-08-19   点击次数:308次

    稳定转染,即进入细胞的质粒整合入细胞基因组中,并能随细胞分裂稳定传递下去。这是相对瞬时转染而言的。

    瞬时转染的表达时间短暂,外源基因导入整合基因组的几率非常低,绝大部分以游离形式存在,不能随细胞分裂而一同复制,导致后拷贝数被稀释,无法达到持续表达外源基因的目的。一般用转染试剂进行质粒转染,多为瞬时转染。

    一般如下情况需要构建稳定株

    1. 长期在目的细胞中研究基因功能,通过构建稳定株,可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本,也极大方便实验研究;

    2. 部分蛋白半衰期极长,瞬时 RNA 只能干扰表达,无法去除已经表达的目的蛋白,通过构建稳定株可以实现更好的基因干扰效果;

    3. 瞬转往往会引入极高拷贝数的表达,导致因为人为因素造成实验结果的不精确,构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究;

    4. 需要用诱导表达系统的,主要是一些致死基因或者是需要时空表达的;

    5. 需要用细胞做动物实验的,比如裸鼠成瘤等,往往需要构建成稳转株。

    构建稳定株的方法

    其实用脂质体转染、磷酸钙转染法等理论上是可以构建稳定株的,但这些方法整合入基因组的效率极低,很难成功。而慢病毒可以携带外源基因随机整合进基因组,效率很高,是建立稳定株的-优方式。



    构建稳定株的注意点

    稳定株构建是个长期过程,从质粒构建到慢病毒包装,再到细胞感染及后期的筛选,每一步都至关重要,所以建立稳转株花个半年时间,也是常有的事,而且要承担病毒包装不成功,细胞感染效率低等风险。
 

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