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做病毒浓缩还在用超高速离心法,太out了!
发布时间:2018-08-20   点击次数:664次


慢病毒(Lentivirus)载体是以人类免疫缺陷I型病毒为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。在转染遗传物质到细胞基因组中的工作中,重组慢病毒载体是一个强大和有效的工具,该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染包括几乎所有的哺乳动物细胞、干细胞和原代培养的细胞,目前慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA干扰、microRNA研究以及活体动物实验中,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。
 

 


慢病毒转染优点:
1.外源基因表达水平较高、表达稳定;
2.转染效率高,可感染分裂和不分裂的细胞,几乎可以感染所有类型的细胞,特别适合质粒载体转染效率低的细胞;
3.慢病毒基因容易操作,易于制备大量病毒且滴度高;
4.病毒基因组可整合到细胞基因组,易于构建稳定细胞株。
 


慢病毒包装技术
慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。将外源基因克隆进入表达载体,同时与包装质粒(表达病毒包装所需辅助蛋白)一起转染细胞,在细胞中进行病毒的包装,包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中,收取培养基离心后可直接用于感染宿主细胞,当目的基因进入细胞后被整合到宿主基因组,从而表达目的基因。

 

 

方法一:超速离心沉淀法
1. 取6个Ultra-clear SW28离心管,用70%乙醇消毒后,放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。
2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管,汲取12 ml 20%的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部,缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。同样地,将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管,对剩下3管进行同样处理。
4. 用PBS调整各管的重量,使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。
5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。
6. 4℃,25,000 rpm. (82,700g) 离心2小时。
7. 小心将管子从转头中取出。倒掉上清,将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。
9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中,盖上盖子。
10. 在4℃溶解2小时,每隔20分钟轻轻震荡。
11. 4℃,500g离心1分钟,使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个SW28离心管中。
13. 集中后的病毒悬液分装成50μl 每份,保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

 


方法二:依科赛慢病毒浓缩液
1.     收集上清液,3000×g离心15分钟清除细胞和细胞碎片。
2.     将上清液转移至无菌容器中,向4V的病毒上清液中加入1V的病毒浓缩液,4°C 孵育过夜(至少12小时)。
3.     混合液1500×g离心 30分钟,在容器的底部可能会出现为米色或白色沉淀。
4.     吸上清,1500×g离心5分钟,吸液去除所有的残留液体,同时特别注意不要破坏已沉淀的病毒颗粒。
5.     用1/10 -1/100体积冷的,无菌PBS缓冲液或DMEM(含25mM HEPES缓冲液)在4℃条件下重悬病毒沉淀。
6.     分装在预冷的小瓶中,-70℃储存,直到使用。

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